ARTIGO DE REVISÃO/REVIEW ARTICLE

Testes pré-natais não invasivos para rastreio de aneuploidias: o estado da arte

Non-invasive prenatal testing for aneuploidy screening: the state-of-the-art

Carolina Vaz-de-Macedo*

Serviço de Ginecologia-Obstetrícia, Hospital Garcia de Orta, E.P.E.Laboratório de Genética e Instituto de Saúde Ambiental, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

*Especialista em Ginecologia/Obstetrícia; Assistente Convidada do Laboratório de Genética e Instituto de Saúde Ambiental da Faculdade de Medicina de Lisboa

Endereço para correspondência | Dirección para correspondencia | Correspondence

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ABSTRACT

Non-invasive prenatal testing (NIPT) is a recent approach to prenatal aneuploidy screening. NIPT has an excellent test performance but it is not a diagnostic test, as there are known limitations associated with false positive and false negative results. When compared to standard screening, pre-test counselling is complicated by concepts such as the possibility of incidental findings. It is important for all the health professionals involved in this field to be familiarised with the state-of-the art knowledge in NIPT. The aim of this article is to review the evidence on the clinical use of NIPT for aneuploidy screening.

Keywords: Prenatal screening; Aneuploidy.

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Introdução

Nas últimas décadas, a medicina fetal tem evoluído com a introdução na prática clínica de novos métodos de rastreio e diagnóstico pré-natal. Embora a lista de testes pré-natais de natureza não invasiva inclua em sentido lato os métodos de imagem e todas as análises ao sangue materno, o termo «teste pré-natal não invasivo» (TPNI) tem sido utilizado como sinónimo da pesquisa de ácidos nucleicos de «origem fetal» no sangue materno. Tem-se assistido a um grande esforço no desenvolvimento e introdução clínica destes testes, com um crescimento exponencial na sua aplicabilidade¹. Acredita-se que, das várias aplicações da pesquisa de ácidos nucleicos de origem fetal em circulação materna, o TPNI para rastreio de aneuploidias seja o de maior impacto na prática clínica¹, reconhecido como o teste genético/genómico de mais rápido crescimento na história da medicina². Perante a rápida evolução na área, o objectivo deste artigo é rever a evidência científica relativa à utilização clínica do TPNI como método de rastreio pré-natal de aneuploidias.

Desenvolvimento e princípios do TPNI

Em 1997, foi identificada pela primeira vez a presença de ácidos desoxiribonucleicos (ADN) circulantes de «origem fetal» no plasma materno³. Foi pouco depois demostrado que este ADN («cell-free fetal DNA», cffDNA) era específico da gravidez, sendo rapidamente eliminado da circulação após o parto⁴. O cffDNA pode ser detectado no plasma materno a partir das 4 semanas de gestação⁵ e a sua fracção aumenta durante a gravidez^6-8, representando uma média de 10% do total de ADN livre em circulação às 12-14 semanas⁹. Estes dados abriram a possibilidade de um rastreio de aneuploidias fetais no sangue materno, baseado sumariamente na comparação entre a quantidade real em circulação e a quantidade expectável de cffDNA com sequências específicas para um determinado cromossoma. Existem diferentes metodologias moleculares em uso para este fim, com distintos graus de amplificação e selectividade para o cffDNA que é analisado. As principais assentam em uma de três bases: sequenciação paralela massiva (MPS) de todo o genoma^10,11, sequenciação paralela massiva (MPS) dirigida^12,13 e sequenciação de SNPs («single-nucleotide polymorphisms»)^14,15. Embora existam diferenças práticas entre estes métodos, o seu desempenho clínico é, em termos gerais, considerado sobreponível¹⁶. O desenvolvimento de ensaios comerciais para estas metodologias culminou com a oferta no mercado de TPNI para rastreio das aneuploidias mais frequentes, disponibilizado pela primeira vez em 2011¹⁷.

O que o TPNI traz de novo

O TPNI pode ser encarado como um teste de rastreio alternativo ou complementar ao rastreio combinado de aneuploidias do primeiro trimestre. Nas mais recentes meta-análises é confirmado um alto desempenho para o rastreio de trissomia 21 (T21), com uma sensibilidade combinada de 99,3-99,7%^6,18,19. O desempenho do TPNI é globalmente mais baixo para a trissomia 18 (T18), trissomia 13 (T13) e monossomia X (MX), com sensibilidades combinadas de 97,4-98,2%, 90,6-99,0% e 92,9-95,8%, respectivamente^6,18,19. O TPNI é um teste altamente específico (99,8-100%) para todas estas aneuploidias^6,18,19, sendo superior ao rastreio «clássico» de aneuploidias (definido como a determinação de marcadores bioquímicos com ou sem avaliação da translucência da nuca às 11-13 semanas)²⁰.

População-alvo

Alto-risco versus população em geral

As primeiras publicações referentes à utilização clínica do TPNI reportavam a uma população de grávidas de risco aumentado para aneuploidias, a quem tinha sido efectuado diagnóstico pré-natal invasivo^21,22. Já a extensão do TPNI à população em geral é marcada por controvérsia. Apesar de o teste ter um bom desempenho neste contexto^23-25, gestações de baixo risco implicam um valor predictivo positivo mais baixo, particularmente para T13 e aneuploidias sexuais²⁶. Um análise-modelo sugeriu que, se forem incluídas na análise as T18, T13 e aneuploidias sexuais, o TPNI tem na realidade uma sensibilidade mais baixa do que o rastreio sequencial como método de rastreio primário²⁷. Contudo, todas as formas de mosaicismo foram consideradas neste modelo como não detectáveis, o que pode não ser uma boa representação da realidade.

A utilização do TPNI está a ser considerada e/ou implementada no sistema público de saúde de vários países como teste contingente após o rastreio combinado no primeiro trimestre, com oferta do teste a gestações de risco intermédio e/ou elevado^28-32. Nesta abordagem, cabe a cada país a definição dos limiares de rastreio adequados no equilíbrio entre a taxa de detecção e a taxa de resultados falsos-positivos^1,33. No Reino Unido, foi estimado que não existirá alteração significativa dos custos quando o TPNI é oferecido como teste contingente para grávidas com um rastreio combinado com risco igual ou superior a 1 em 150³⁴. Já na Holanda, foi estimado um aumento de 21% nos custos directamente relacionados com o rastreio³⁵. No cenário norte-americano, uma análise de modelação sugeriu que o TPNI não será mais dispendioso do que o rastreio clássico de aneuploidias quando considerados os custos relacionados com o nascimento de crianças com as aneuploidias rastreadas³⁶. Perante dados limitados sobre o custo-eficácia do TPNI, o American Congress of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) recomenda a manutenção dos métodos convencionais como primeira linha de rastreio de aneuploidias¹⁶.

Gestações múltiplas

Embora o uso do TPNI nas gestações múltiplas tenha defensores³⁷, existem limitações associadas a esta prática. Para além da incapacidade de distinção de qual/is dos fetos contribuiu/ram para um resultado alterado, existe um pequeno número de casos de gestações gemelares incluídas nos estudos publicados, com valores de sensibilidade variáveis^19,38,39 e com uma maior taxa de resultados inconclusivos³⁹. Este menor desempenho parece encontrar-se relacionado com a menor fracção fetal de cada co-gémeo em comparação com fetos em gestações simples, o que pode dever-se a um maior efeito de diluição pela particular expansão de volume plasmático materno³⁸. Ainda assim, é importante salientar que o rastreio combinado do primeiro trimestre, que é a principal alternativa na gravidez de baixo risco, também apresenta um menor desempenho nas gestações múltiplas do que nas gestações simples⁴⁰. Muito embora não se tenha encontrado um estudo comparativo directo entre estas abordagens, uma revisão do tópico sugere que o TPNI tem um melhor desempenho na gravidez gemelar do que o rastreio combinado do primeiro trimestre⁴¹.

Por que o TPNI não é um teste diagnóstico

Apesar do excelente desempenho do TPNI como teste de rastreio, a existência de resultados falsos-positivos e falsos-negativos preclude a sua utilização como teste de diagnóstico - Quadro I. A este nível, é importante ter em consideração a natureza do cffDNA, que é na realidade de origem trofoblástica^42-45, bem como o facto de esta avaliação ser efectuada numa amostra de sangue materno.

 

 

Resultados falsos-positivos

Resultados falsos-positivos podem ocorrer como resultado de alterações confinadas à placenta. Apesar de o mosaicismo feto-placentário ser uma causa reconhecida de resultados discordantes no TPNI⁴⁶, a percentagem mínima de mosaicismo necessária para o resultado ser positivo é desconhecida e pode ser dependente quer do tipo de tecnologia utilizada quer do tipo de aneuploidia presente^47,48. Os resultados do TPNI foram inconsistentes em casos de mosaicismo fetal confirmado por cariótipo^49-51.

O cffDNA de um «gémeo desaparecido» (vanishing twin) também pode levar a uma representação errónea da constituição cromossómica do co-gémeo vivo⁵². O TPNI baseado em SNPs oferece a possibilidade de detecção de haplotipos fetais adicionais, o que pode ser útil na síndrome do «gémeo desaparecido», bem como em gestações múltiplas não reconhecidas antes da colheita de sangue e em gestações triplóides⁵³. Ainda assim, é importante referir que este teste baseado em SNPs não se encontra clinicamente validado para o rastreio de aneuploidias em gestações múltiplas⁵³.

Dada a natureza do TPNI como um teste ao sangue materno, uma outra causa de resultados falsos-positivos relaciona-se com achados inesperados (e provavelmente não desejados) referentes à grávida. Uma implicação chocante do TPNI é a detecção acidental de patologia maligna materna por um resultado onde são reveladas alterações cromossómicas atípicas^54,55. Embora tal possa parecer benéfico, na realidade uma detecção mais precoce de cancro pode não melhorar o desfecho devido a um viés de tempo de sobrevivência após o diagnóstico («lead time bias») ou à incapacidade de intervir na história natural da doença⁵⁶.

Adicionalmente, o TPNI está associado a um aumento da consciencialização relativa a alterações cromossómicas da própria grávida. Por exemplo, numa análise de 109 casos consecutivos de resultado discordante de TPNI, 8,6% das aneuploidias sexuais detectadas eram na realidade de origem materna²⁶. Foram ainda relatados casos de resultados falsos-positivos para T18 e monossomia 13 por duplicações 18q maternas e por um mioma uterino de grandes dimensões, respectivamente^57-59. Um estudo recente em que foram incluídos 74 casos falsos-positivos revelou que 8,1% destes se reportavam a aneuploidias maternas⁶⁰.

Resultados falsos-negativos e inconclusivos/não-reportáveis

Os resultados falsos-negativos em TPNI relacionam-se especialmente com a inexistência de uma proporção suficiente de ADN de origem fetal para que uma quantidade anormal de um determinado cromossoma seja detectada como um desvio do normal (num conjunto de fragmentos de ADN que são maioritariamente maternos, pelo que provavelmente euplóides). Para que esta dita fracção fetal seja suficiente para resultados conclusivos, é recomendada uma idade gestacional de pelo menos 9-10 semanas para a utilização clínica do TPNI⁶¹. No entanto, este valor, e consequentemente a taxa de resultados inconclusivos/não-reportáveis, é dependente de factores como o peso materno e a existência de hipertensão crónica^7,8,62,63. É sugerido um limite mínimo de 4% para a emissão de um relatório⁵¹. Nos casos em que o resultado seja inconclusivo pode ser efectuada uma nova colheita, sendo que a fração fetal é geralmente superior nessa segunda amostra⁸. Por exemplo, nas grávidas com um índice de massa corporal superior a 35 kg/m², a probabilidade de um resultado inconclusivo diminui com o aumento da idade gestacional, deixando de ser superior à das grávidas normoponderais a partir das 21 semanas de gestação⁶⁴. É, assim, razoável adiar por algumas semanas a colheita de sangue neste grupo populacional como estratégia para diminuir a probabilidade de falsos positivos⁶⁴.

Foram recentemente desenvolvidos novos métodos para quantificação da fracção fetal no plasma materno^65,66 e deve ser considerado que abordagens distintas têm diferentes limites de detecção⁶⁷. Uma revisão da taxa de falha em reportar um resultado mostrou que esta varia entre 1,58% para os métodos baseados em MPS e 6,39% nos métodos baseados em análise de SNPs⁶⁸. Por outro lado, sabe-se que a percentagem de cffDNA em circulação é maior na T21 e menor nas T18, T13 e monossomia X em comparação com fetos euplóides^62,69. Em concordância com este dado, nos casos de falha de resultado existe um risco aumentado para T18 e T13, mas não para T21⁷⁰.

Na presença de malformações fetais detectadas por ecografia, o valor predictivo positivo do TPNI atinge valores superiores a 90% (mas ainda assim não é diagnóstico)⁷¹. Devido à possibilidade de resultados falsos-negativos, a utilização do TPNI em casos de malformações fetais é desencorajada por certas sociedades profissionais, pois um resultado negativo poderá não ser suficientemente tranquilizador^16,72. Ainda assim, esta recomendação não é seguida de forma universal⁷³.

Impacto no diagnóstico pré-natal

Perante um resultado de rastreio por TPNI com risco aumentado para uma dada aneuploidia, e face a um desejo expresso de interrupção de gravidez, é essencial a confirmação por um teste invasivo^16,72,74. Infelizmente, existem casos na literatura em que o procedimento de interrupção de gravidez foi accionado sem teste confirmatório da presença de aneuploidia⁷¹. É ainda importante salientar que as utilizadoras do TPNI incluem mulheres que não aceitariam técnicas invasivas de diagnóstico pré-natal face ao seu risco, mas pretendem informação precoce para preparação do nascimento de uma criança afectada^75,76. O número de amniocenteses e biopsias de vilosidades coriónicas (BVCs) poderá ser significativamente reduzido^77-79, com diminuições de 53-77% reportadas em comparação com coortes históricos de grávidas^77,79. Dado que os riscos associados ao diagnóstico pré-natal invasivo são dependentes da experiência do operador⁸⁰ e que esta será previsivelmente menor, foi proposta a utilização de simuladores no treino inicial para procedimentos invasivos⁸¹.

Também o diagnóstico pré-natal ecográfico de malformações fetais não deverá ser substituído pelo TPNI, continuando a existir um óbvio papel a este nível para a ecografia fetal^16,72. Foram publicadas recentemente novas recomendações sobre o papel da ecografia nas grávidas que realizaram TPNI, na tentativa de esclarecer a conduta perante a presença de marcadores minor de aneuploidias neste grupo de gestações⁸². A este nível, é importante salientar que o cálculo de risco por métodos convencionais (como o rastreio combinado do primeiro trimestre) é claramente desaconselhado nas grávidas que já são portadoras de um resultado de TPNI^59,72. Também a pesquisa sistemática de vários marcadores minor de aneuploidias é desaconselhada neste grupo, pela alta taxa de resultados falsos-positivos e baixo valor preditivo do positivo a que se associará⁷².

Existem dados limitados na literatura sobre o melhor teste confirmatório perante um resultado de TPNI de risco aumentado para uma dada aneuploidia. Uma análise teórica baseada em amostras de biopsia de vilosidades coriónicas (BVS) sugeriu que o risco de mosaicismo placentário após um TPNI de risco aumentado depende da aneuploidia específica detectada⁴⁷. Em particular, face ao elevado risco de mosaicismo na T13 e MX, foi sugerida uma abordagem cautelosa com evicção da BVC como teste confirmatório neste grupo⁴⁷. Outros autores sugerem BVC com análise directa e por cultura de todas as amostras, com amniocentese confirmatória nos casos de discordância entre os resultados obtidos pelas duas técnicas⁸³.

Novas abordagens

Novas abordagens em estudo incluem optimizações do TPNI para melhoria do seu desempenho no rastreio de aneuploidias sexuais⁸⁴, do valor preditivo do positivo (através de método de sequenciação shotgun com automação completa)⁸⁵ e da distinção da origem materna de alterações⁸⁶. A aplicação de uma técnica quantitativa, «droplet digital PCR (ddPCR)»^87,88, associa-se à promessa de uma diminuição nos gastos associados ao TPNI^89-91 com detecção de T21 a partir de uma fracção fetal de 5%⁹². No extremo oposto de custos, após publicação em 2013 de um estudo de princípio para a detecção de alterações sub-cromossómicas (isto é, anomalias cromossómicas limitadas a parte de um cromossoma - como é o caso das micro-delecções) através da utilização de uma abordagem de MPS⁴⁷, esta possibilidade também passou a encontrar-se disponível comercialmente⁹³. No entanto, a implementação da prática clínica corrente desta versão «expandida» do TPNI tem vindo a ser questionada^94,95. Apesar dos avanços na técnica de sequenciação^96,97, foi recomendada prudência pelo facto de a baixa prevalência destas patologias implicar um valor predictivo positivo limitado⁹⁸, aliás confirmado na prática clínica⁹⁹. Também a este nível, a presença de mosaicismo placen­tário é uma possível causa de resultados falsos-positivos¹⁰⁰.

Ainda assim, a evidência de que os genomas materno e fetal completos estão presentes no plasma materno a uma percentagem relativa constante é um argumento a favor o uso do TPNI com análise de todo o genoma⁸⁷. De facto, o TPNI poderá vir a fornecer a mesma quantidade de informação que um array⁴⁹. Em tal cenário, os serviços de saúde terão de estar preparados para lidar com variantes de significado indeterminado («variants of unknown/uncertain significance» - VOUS) e «zonas-cinzentas» no aconselhamento e orientação das grávidas e casais¹⁰¹.

Implicações para os serviços de saúde: política e ética

Foi alegado que os grandes desafios relativos à utilização do TPNI não são de natureza técnica, mas sim a nível de políticas de saúde¹. De facto, a comercialização do TPNI levantou novas questões, com a publicação recente de vários consensos e recomendações por parte das sociedades profissionais de vários países na tentativa de uniformização da prática clínica^{16,61,72,74,102,103}.

As grávidas encaram de forma positiva a inclusão do TPNI como oferta¹⁰⁴, com elevada intenção/efectivação de adesão^79,105,106. No entanto, a provisão de uma adequada informação pré-teste é desafiante e complicada por questões como a possibilidade de achados acidentais¹⁰⁶ - amplificada se se optar por incluir a «versão expandida» com rastreio de microdelecções¹⁰⁸. Por exemplo, um estudo recente mostrou que, na maioria dos casos, as grávidas não são informadas sobre a possibilidade de achado acidental de neoplasia materna¹⁰⁹. É expectável que a introdução do TPNI se reflicta numa sobrecarga para os profissionais de saúde envolvidos no rastreio pré-natal¹¹⁰ e é possível que a maior complexidade do teste prejudique o processo de escolha informada¹¹¹. Uma das principais preocupações das partes envolvidas é a possibilidade de «normalização» do teste, com um aumento da pressão social para realização do teste dada a sua segurança¹¹². Ainda assim, foram encontradas taxas elevadas de escolha informada quer em contexto de investigação¹¹³ quer na utilização clínica do TPNI⁷⁶, sendo que a maioria das mulheres compreende a existência de um risco residual após um resultado de baixo risco¹¹⁴.

Em 2014, o TPNI já se encontrava disponível em mais de 60 países¹¹⁵. Questões demográficas, culturais e legais seguramente influenciarão a sua implementação e aceitação regional^116,117. Uma sondagem a profissionais de saúde confirmou que a informação e o acesso ao TPNI são heterogéneos, com uma grande variabilidade do preço do teste¹⁷. Esta heterogeneidade levanta a questão da discriminação injusta com subsequente enfraquecimento da autonomia reproductiva das grávidas¹¹⁸.

Por outro lado, a implementação do TPNI pressupõe uma visão crítica renovada sobre os limites dessa mesma autonomia reprodutiva¹¹⁹. Por exemplo, a sua utilização precoce poderá possibilitar aos pais uma interrupção de gravidez dependente do sexo do feto⁷⁴. Também a posição das pessoas e famílias das pessoas afectadas pelas doenças alvo do TPNI deverá ser tida em conta⁷⁴. Um grupo de pais de crianças com T21 exprimiu várias preocupações sobre o TPNI, relacionadas em particular com o possível impacto deste teste na forma como a sociedade encara os indivíduos afectados¹²⁰. Finalmente, e de um ponto de vista legal, poderão aumentar os processos nas chamadas «acções de vida» («wrongful life» e «wrongful birth») por uma atitude expectante perante uma forte suspeita de aneuploidia¹¹⁷.

Conclusão

O extraordinário desenvolvimento da tecnologia relacionada com o TPNI a que se assistiu nas últimas duas décadas originou uma rápida expansão comercial que não terá sido prevista pela maioria dos profissionais de saúde envolvidos em diagnóstico pré-natal. O TPNI é um excelente método de rastreio de aneuploidias, mas não é isento de limitações e de questões em aberto. É vital o fornecimento de informação adequada e abrangente a todos os profissionais envolvidos no processo de aconselhamento das grávidas para que a implementação desta tecnologia possa decorrer de forma responsável¹¹⁷. É nossa expectativa que este artigo de revisão em Língua Portuguesa seja um passo nesse sentido.

 

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Endereço para correspondência | Dirección para correspondencia | Correspondence

Carolina Vaz-de-Macedo

Hospital Garcia de Orta, E.P.E.

Serviço de Ginecologia-Obstetrícia

Av. Torrado da Silva

2805-267 Almada, Portugal

E-Mail: carolina.macedo@hgo.min-saude.pt

 

Recebido em: 17/03/2017

Aceite para publicação: 25/06/2017